Moco

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 21768 (2022) Citar este artículo

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La babosa Arion vulgaris ha atraído gran atención como una de las peores plagas herbívoras invasoras de Europa y es famosa por la mucosidad dura que secreta para la locomoción. En este estudio nos centramos en el aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares, específicamente exosomas y vesículas similares a exosomas, a partir de secreciones de Arion. Desarrollamos un método para la recolección de moco de babosas y el posterior aislamiento de vesículas mediante ultracentrifugación. Las vesículas aisladas con un diámetro promedio de ~100 nm transportan abundantes proteínas y ARN cortos, así como moléculas de adhesión similares a las galectinas de los mamíferos. Demostramos que las vesículas extracelulares de babosas son internalizadas por células vegetales y células cancerosas humanas en ensayos in vitro y pueden cargarse con compuestos bioactivos, lo que las convierte en una herramienta interesante para su utilización en biotecnología.

Las babosas españolas (Arion vulgaris, Moquin-Tandon, 1855) son las especies de gasterópodos europeos más comunes y figuran entre las peores plagas invasoras de Europa. Las babosas Arion son herbívoros voraces que se sabe que causan importantes daños ecológicos1,2,3,4,5 y económicos6,7. Además, actúan como vectores de bacterias patógenas y como huéspedes de parásitos, que dañan a las mascotas domésticas y al ganado8,9,10. Arion vulgaris produce un moco ventral altamente viscoso, pegajoso y difícil de eliminar, generado principalmente por cinco tipos de glándulas subepiteliales ubicadas lateralmente y ventralmente, lo que le permite superar muchos tipos de superficies y obstáculos naturales y artificiales que podrían contribuir al éxito de su dispersión geográfica. y el nivel de infestación actual en toda Europa11,12,13.

En este estudio decidimos buscar vesículas extracelulares, específicamente exosomas y vesículas similares a exosomas (EX) en el moco de Arion. Las EX son vesículas extracelulares con un diámetro promedio de ~ 100 nm que se generan en el compartimento endosómico de la mayoría de las células eucariotas con un enorme potencial en aplicaciones biomédicas (como se revisa detalladamente en 14, 15). Por ejemplo, la doxorrubicina (DOX, Adriamycin) aislada de Streptomyces sp. utilizado frecuentemente como terapia de primera línea para una variedad de neoplasias malignas sólidas (aprobado por la FDA en 1974) es conocido por su toxicidad cardíaca y sistémica grave dependiente de la dosis, que podría reducirse significativamente mediante la conjugación con exosomas derivados de células humanas in vitro. culturas16.

Además de los mamíferos como fuente tradicional de EX para investigación y terapias recientes, las fuentes de EX no mamíferas están ganando popularidad recientemente por sus interesantes propiedades y funciones complejas (que van desde interacciones entre especies hasta comunicación entre reinos)17,18. 19,20,21,22. Los EX de diversas fuentes, como los productos de las abejas, el veneno de serpiente o las plantas y frutas, se están convirtiendo en una caja de herramientas cada vez más convincente para la industria agrícola, farmacéutica y biomédica17,20,23,24. Inspirados por el progreso en este campo de investigación (y por la disponibilidad de las babosas de Arion para el aislamiento potencial de EX a gran escala), nos propusimos inspeccionar el pestífero Arion vulgaris como una posible fuente alternativa de EX para aplicaciones en biotecnología.

En este estudio, proporcionamos un método simple y eficiente para la recolección de moco de babosas y el posterior aislamiento de EX mediante ultracentrifugación. Las babosas EX se caracterizaron y visualizaron mediante análisis de tamaño de nanopartículas y microscopía electrónica de transmisión, junto con el perfil de distribución de tamaño proporcionado por la técnica de dispersión dinámica de luz. El contenido de proteína EX se cuantificó mediante los ensayos de cuantificación de proteína CBQCA y ácido bicinconínico, se realizó el aislamiento de ARN y se verificó la presencia de moléculas de adhesión mediante transferencia Western. Además, se demostró la eficacia modelo de carga de fármacos de las babosas EX junto con la absorción celular en condiciones in vitro.

La presencia de EX en el moco recolectado de babosas Arion vulgaris se verificó mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), como se muestra en las (Fig. 1a-d). La concentración de babosas EX en un aislado diluido 100 × fue de 5,27 × 109 (± 6,65 × 107) partículas/ml con un diámetro medio de 154,2 nm (± 43,4 nm) según lo determinado por NTA. Los EX tienden a formar agregados, como lo demuestra el análisis de un registro de vídeo de las partículas que se mueven bajo el movimiento browniano. Como lo muestra DLS, el 90% de los EX se agrupan dentro del rango de tamaño de 40 a 160 nm. El análisis TEM confirmó la presencia de vesículas de forma redonda de varios diámetros que van desde 44 a 160 nm.

Caracterización de Slug EX. ( a ) Histograma representativo que ilustra la distribución del tamaño de las nanopartículas de babosas EX en suspensión líquida según lo determinado por el análisis de seguimiento de nanopartículas. (b) Visualización de los EX individuales (puntos blancos individuales de varios tamaños) y sus agregados (flechas rojas) a partir de una grabación de video de las partículas que se mueven bajo el movimiento browniano. (c) Histograma representativo que ilustra la distribución de tamaño de las babosas EX según lo determinado por el análisis dinámico de dispersión de luz. ( d ) Micrografías electrónicas de transmisión de babosas EX que muestran estructuras vesiculares.

La concentración promedio de proteína en el lisado de babosa EX fue de 108,71 μg (± 4,79 μg) por 1010 partículas según el ensayo de proteína BCA en comparación con el contenido promedio de proteína de 429,32 mg (± 210,49 mg) por 1010 partículas, cuando se cuantificó utilizando la proteína CBQCA. ensayo (Fig. 2a). Dado que el BCA, uno de los métodos más utilizados en la literatura para cuantificar los exosomas y su contenido de proteínas, podría producir valores erróneos cuando están presentes lípidos/fosfolípidos de membrana comunes25,26, la combinación del ensayo de proteínas NTA y CBQCA debería ser el método preferido para las babosas EX y su cuantificación de proteínas.

Análisis de contenido de Slug EX. ( a ) Comparación de las concentraciones de proteínas EX proporcionadas por los ensayos de cuantificación de BCA y CBQCA. ( b ) contenido de ARN de las babosas EX. (c) ARN aislado de las babosas EX (carril 3) en comparación con el ARNip de control de carga (dúplex de 21 unidades con saliente dTdT, Sigma-Aldrich; carril 2) y con la escalera de ADN (banda más baja = 250 pb; carril 1). (d) Análisis de transferencia Western del lisado de slug EX utilizando un anticuerpo primario Galectina-1/LGALS1 contra la proteína galectina-1 humana (para las transferencias Western y geles no recortados, consulte los datos complementarios).

Las babosas EX contenían 4,09 μg (± 0,91 μg) de ARN por 1010 partículas (Fig. 2b). La fracción principal de ARN aislado de las babosas EX consistía en abundantes ARN cortos con un tamaño aproximado <250 bases (Fig. 2c). Utilizando transferencia Western con anticuerpos primarios contra marcadores exosomales y moléculas de adhesión: lectinas (galectina-1, 3, 8, 9) que se sabe están presentes en las EX humanas, pudimos identificar una de las proteínas EX de babosa como una proteína similar a la galectina-1. (Fig. 2d), como lo muestra la banda de tamaño entre 14 y 15 kDa.

La capacidad de carga de doxorrubicina (DOX) mediante slug EX se analizó mediante cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), lo que confirma la absorción exitosa de 1,26 µg (± 0,59 µg) del ion precursor doxorrubicina por 1010 partículas. La eficacia de carga de EX estimada de aproximadamente 2,5 % se calculó comparando la concentración de entrada inicial de DOX con la concentración final de DOX-EX (100 µg/ml de DOX frente a 2,5 ± 0,27 µg/ml de DOX-EX) después de la coincubación y pasos de lavado posteriores (Fig. 3a, b).

Slug EX cargando con DOX. (a) Después de la coincubación de DOX con EX durante 2 h a 37 °C, (1) se aplicaron dos pasos de lavado posteriores para eliminar el DOX residual no unido. La mezcla se ultracentrifugó durante 30 min a 100.000 xg, se descartó el sobrenadante que contenía el DOX libre, se lavó el sedimento que contenía las nanovesículas con PBS, se resuspendió en 1 ml de PBS y se repitió este paso (2.–3.) antes. cuantificación del DOX unido a EX mediante LC-MS/MS (4). (b) Adopción resultante del DOX por 1010.

El ensayo de internalización celular in vitro de babosas EX teñidas con BODIPY TR Ceramide confirmó la absorción de EX por el glioblastoma humano U87 y las células vegetales BY-2, como lo demuestran las imágenes de microscopía confocal (Fig. 4a, b). Después de la internalización de las EX teñidas, el tinte fluorescente fue claramente detectable en el citoplasma de líneas celulares tanto humanas como vegetales.

Ensayos de absorción celular de Slug EX. ( a ) Análisis de microscopía confocal de barrido láser de las células de glioblastoma humano U87 después del ensayo de captación de EX teñidos con ceramida BODIPY TR. Barra de escala = 10 µm. (b) Análisis de microscopía confocal de las células vegetales BY-2 después del ensayo de absorción de EX. Barra de escala = 50 µm.

El moco de los gasterópodos terrestres (caracoles y babosas) es una sustancia compleja secretada generalmente por glándulas epidérmicas que recubren la superficie externa de los animales y que tiene diversas funciones y propiedades (hidratante, lubricante, adhesiva, reparadora, protectora, defensiva, etc.)27. 28,29. Su composición puede variar entre especies y según su función30,31, pero generalmente se compone de más del 90 % de agua y una variedad de proteoglicanos, glucosaminoglucanos, enzimas glicoproteicas, ácido hialurónico, péptidos de cobre, péptidos antimicrobianos, antifúngicos y antivirales31,32, y iones metálicos33,34,35. Se sabe que las babosas que carecen de la capa protectora de los caracoles secretan un moco extremadamente rígido cuando están en peligro o son molestadas por depredadores o humanos36,37,38.

Las secreciones de caracoles y babosas demostraron ser sustancias excepcionalmente prometedoras para su uso en biomedicina y la industria cosmética, así como para aplicaciones industriales12,39,40,41,42,43,44,45. El moco contiene proteínas como colágeno, elastina, ácido glicólico (capaz de penetrar la piel y provocar una mayor síntesis de colágeno46) y alantoína (conocida por promover la cicatrización de heridas y la proliferación celular47,48). El moco de caracol muestra potencial para regenerar y reparar huesos y dientes49. Inspirándonos en estos estudios, nos centramos en inspeccionar el moco de Arion para detectar la presencia de EX, que se propuso que fueran un componente común de las secreciones animales18. Las babosas EX aisladas muestran una distribución de tamaño similar a las fuentes de mamíferos/humanos y transportan una carga típica, como proteínas y ARN cortos.

La mayor parte de la atención en el campo de la investigación de EX se ha centrado en fuentes de EX humanas (mamíferos), proporcionando una comprensión básica de su papel en los procesos biológicos e investigando su uso potencial en biomedicina. Sin embargo, existe un interés creciente en las fuentes menos convencionales, que van desde invertebrados hasta plantas y hongos17,50,51,52. Las EX no se limitan únicamente a la comunicación dentro de un individuo o dentro de ciertas especies, sino que se ha demostrado repetidamente que proporcionan interacciones entre especies y entre reinos18. Además de su importante papel en la comunicación entre células (actuando como vehículos para moléculas específicas como proteínas, enzimas, factores de crecimiento o ARN), se demostró que las EX representan un mecanismo general para mediar la comunicación dentro de las interacciones huésped-parásito. Se sabe que actúan como portadores de factores de virulencia y diversas proteínas efectoras desde los parásitos hasta sus huéspedes. En consecuencia, las EX son de particular interés para la biomedicina ya que median y modulan respuestas y procesos patógenos mediante la modificación de la expresión genética del huésped y la respuesta del sistema inmunológico del huésped21. Sin embargo, una infección (o infestación en el caso de las babosas) tiene un efecto bidireccional entre el parásito y su huésped y, en consecuencia, se producen EX como respuesta a los parásitos. Se demostró que las plantas EX participan en la comunicación entre las plantas y sus patógenos mediante el transporte de diversas proteínas y pequeños ARN. Durante la infección fúngica de la planta, pequeños ARN como miR166 y miR159 se transportan a través de EX de la planta a las hifas del hongo, donde regulan la expresión de enzimas de virulencia53. Sin embargo, el transporte de biomoléculas puede ser bidireccional, ya que pequeños ARN del hongo pueden apuntar a genes de defensa de las plantas54.

Nuestros datos apoyan la hipótesis de una interacción recíproca posiblemente compleja por parte de los EX en el papel de mediadores de respuesta entre el herbívoro Arion y su dieta vegetal. Las babosas EX están cargadas con proteínas y ARN cortos y se demostró que son internalizadas por células vegetales en condiciones in vitro (Fig. 4a, b). Se sabe que las plantas responden a la herbivoría de manera similar a las infecciones, utilizando diversos mecanismos bioquímicos y moleculares para contraatacar al organismo que se alimenta. Algunos de los compuestos generados por las plantas son sustancias defensivas que afectan los procesos de alimentación, crecimiento y supervivencia del herbívoro55,56. En respuesta, la voraz Arion vulgaris podría utilizar EX para modificar la respuesta al estrés de la planta a su favor. Otro posible papel de las babosas EX es la protección de las babosas contra infecciones por bacterias o virus, así como contra sus depredadores potenciales o en la mediación de la comunicación con otras babosas Arion o gasterópodos terrestres a través de los senderos mucosos29,57,58,59,60. Puede que valga la pena investigar el potencial de las babosas EX como herramienta para la modificación de plantas en biotecnología vegetal o como herramienta para el control de plagas de gasterópodos en la agricultura.

Los EX son cada vez más populares en el campo de la biomedicina. La mayoría de los ensayos clínicos en curso centrados en exosomas se concentran en EX de origen humano como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico (es decir, para muchos tipos de cánceres). Sin embargo, varios ensayos ya se centran en el uso de EX como agentes terapéuticos en diversos tipos de enfermedades (como se revisó recientemente en 61). Los EX como herramienta para aplicaciones de administración de células muestran una inmunogenicidad reducida en comparación con los vectores virales, estabilidad en el torrente sanguíneo y un mayor potencial de absorción en comparación con los liposomas, y tienen la capacidad de superar barreras fisiológicas (es decir, la barrera hematoencefálica)62. Dado que el flujo de trabajo para la caracterización de EX humanas ya estaba establecido en nuestro laboratorio (es decir, panel de anticuerpos contra moléculas de adhesión exosomal y marcadores de origen humano), decidimos utilizar nuestro conjunto de anticuerpos primarios contra moléculas de adhesión exosomal humanas (lectinas) para buscar elementos relacionados. moléculas en las babosas EX. La señal positiva para el anticuerpo galectina-1 humana en las babosas EX reveló la presencia de proteínas similares a la galectina-1 humana. Las galectinas son una familia de lectinas solubles no glicosiladas de pequeño peso molecular entre 14 y 39 kDa que se unen a motivos basados ​​en galactosa y N-acetillactosamina que están ampliamente conservados en todas las especies y se han relacionado con la captación de exosomas por parte de las células diana63,64 . En humanos, la galectina-1 se une a la superficie de los exosomas derivados de células del estroma mesenquimatoso placentario, células tumorales o sincitiotrofoblastos y participa en la adhesión de exosomas65,66,67. Además, se demostró que la absorción de EX enriquecidas con galectina-1 por células cancerosas humanas conduce a la regulación positiva de su concentración intracelular, lo que afecta fuertemente la migración de las células cancerosas68. Según nuestros datos (Fig. 2d), la proteína similar a la galectina-1 está presente en las babosas EX, posiblemente cumpliendo una función análoga en la adhesión y absorción de las EX, lo que sugiere que las babosas EX podrían servir como un vehículo eficiente para moléculas bioactivas en humanos. células cancerosas en terapias basadas en administración celular.

DOX es uno de los cancerostáticos más utilizados para el tratamiento de multitud de cánceres. Induce la muerte celular a través de múltiples objetivos intracelulares: generación de especies reactivas de oxígeno, formación de aductos de ADN, inhibición de la topoisomerasa II, expulsión de histonas o regulación de la homeostasis del Ca2+ y el hierro16. Uno de los numerosos inconvenientes de la DOX es su toxicidad cardíaca y sistémica grave, dependiente de la dosis69. Se demostró que la encapsulación de DOX en sistemas de administración de fármacos de partículas a nanoescala ofrece una biodistribución, farmacocinética y liberación controlada ventajosas, al tiempo que reduce su toxicidad sistémica70. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios sistemas de conjugación DOX basados ​​en nanotecnología, algunos de los cuales han recibido la aprobación de la FDA16. En particular, los exosomas son conocidos por su capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica y ser internalizados en ciertas células cerebrales (como las células de glioma). Se demostró que la administración de DOX a las células de glioblastoma a través de exosomas inhibe sustancialmente el crecimiento tumoral en un modelo de pez cebra71.

Se utilizaron varios métodos de carga en experimentos de carga de exosomas, siendo la coincubación directa el procedimiento más estudiado debido a su simplicidad y falta de impactos notables en la estructura y el contenido de los exosomas72. Las sustancias solubles como el DOX no pueden precipitarse después de la centrifugación y pueden desecharse en el sobrenadante de la ultracentrífuga71,73, por lo que la estrategia más frecuente para aislar el DOX libre residual de los EX cargados es la separación basada en centrifugación72. En este sentido, realizamos un experimento de prueba de concepto simple para verificar el potencial de las babosas EX para aplicaciones de administración de células y hemos demostrado que las babosas EX se pueden cargar mediante compuestos bioactivos, como lo confirmó un ensayo de carga de DOX mediante carga pasiva. (co-incubación directa de EX con DOX). La capacidad de carga relativamente baja de las babosas EX (aproximadamente 2,5%) sería suficiente para su uso en terapias humanas, pero la eficacia podría mejorarse significativamente mediante el uso de enfoques de carga activa (es decir, electroporación o sonicación).

Finalmente, como lo demuestra la microscopía confocal (Fig. 4a, b), se demostró que las babosas EX son internalizadas por células de glioblastoma humano, que sirven como un modelo in vitro de sistema de administración de células para EX de fuentes convencionales.

Hasta ahora, las células madre mesenquimales humanas o las células dendríticas humanas son las principales fuentes de EX terapéuticas75. Cultivar estos cultivos celulares en condiciones in vitro en cantidades suficientes para la recolección de EX es laborioso y económicamente exigente (es decir, consumo de medios de cultivo celular de alta calidad), lo que hace que la búsqueda de alternativas más baratas y abundantemente disponibles sea extremadamente atractiva. Sumado a las bajas exigencias para el cultivo de babosas Arion en condiciones de laboratorio, el enorme daño ecológico y económico causado por este "supervillano" podría compensarse, al menos en parte, proporcionando una herramienta interesante para la biotecnología y la biomedicina en un futuro próximo.

Se recolectaron 2 kg de babosas Arion en jardines privados durante las temporadas de verano de 2021 y 2022 en el noroeste de Bohemia (República Checa). Antes de la recolección de moco, las babosas se mantuvieron en jaulas de plástico o acuarios de vidrio llenos de tierra de jardín y restos de madera y se alimentaron con ensalada verde fresca y pepinos picados ad libitum durante al menos 48 h para adaptarse completamente a las condiciones artificiales del laboratorio. Después del proceso de recolección de moco, las babosas fueron devueltas a su hábitat natural. La identificación de las especies fue realizada por el Departamento de Biología de la Universidad Jan Evangelista Purkyně en Ústí y Labem.

Antes de la recolección de moco, cada babosa se enjuagó minuciosamente con agua del grifo para eliminar los restos y las heces adheridos, seguido de un breve enjuague con agua desionizada. Se transfirieron 250 a 300 g de babosas enjuagadas (20 a 25 individuos) a vasos de precipitados de 600 ml llenos con 50 ml de solución salina tamponada con fosfato 0,01 × + KCl 0,0027 M + NaCl 0,137 M, pH 7,4 (PBS) (solución de moco recogida de dos vasos de precipitados). se reunió para los pasos posteriores) o se transfirieron de 600 a 750 g de babosas (aproximadamente 50 individuos) a un recipiente de vidrio de 2 l lleno con 100 ml de PBS (Fig. 5f, g). Sólo se utilizaron animales maduros y completamente activos dentro del rango de peso de 12 a 15 g. Después de la transferencia, las babosas se agitaron suavemente manualmente en el tampón durante 10 minutos y se dejaron salir del recipiente, dejando la solución de moco en el fondo del recipiente. A partir de entonces, las babosas se enjuagaron con agua del grifo, se devolvieron a sus contenedores, se alimentaron y se dejaron recuperar. La solución de moco obtenida se diluyó con PBS adicional hasta un volumen total de 0,5 ly se agitó en el balancín durante 24 h a 4 °C. Luego, la solución de moco se filtró utilizando una serie de 3 tamices de cocina (Zpts Kolbiarz) con un tamaño de malla decreciente (X = 1 × 1 mm, Y = 0,75 × 0,75 mm, Z = filamentos de tejido apretado; Fig. 5a, e). para eliminar la fracción rígida e insoluble del moco que forma una capa espumosa rígida en la parte superior de la solución de moco varios minutos después de la recolección (Fig. 5b-d). Después de filtrar a través de los tamices de la cocina, sólo se recogió para la centrifugación la fracción completamente licuada.

Procedimiento de recolección de moco. (a) Se utilizaron tamices de cocina comúnmente disponibles con un tamaño de malla decreciente (X = 1 × 1 mm, Y = 0,75 × 0,75 mm, Z = filamentos de tejido apretado) para filtrar la fracción rígida e insoluble del moco. (b) Fracción del moco que queda después de la filtración con X; Y = (c); Z = (d). (e) Detalle de los filamentos de la malla de Z bajo el microscopio (sin embargo, cualquier tamiz con un tamaño de malla de 0,5 × 0,5 mm hasta 0,2 × 0,2 mm podría usarse con la misma eficacia). ( f, g ) Después de la incubación de las babosas en el tampón PBS, las babosas salen espontáneamente de los recipientes que se van a recolectar, se enjuagan suavemente con agua del grifo y se dejan recuperar.

La centrifugación diferencial se llevó a cabo en Avanti JXN-26 equipado con un rotor de ángulo fijo JLA 9, 1000 (Beckman Coulter). Primero, la solución de moco se centrifugó a 2000 xg durante 20 minutos a 4 °C y el sobrenadante se transfirió a una botella de centrífuga limpia de 500 ml. Posteriormente, la solución se centrifugó a 10.000 xg durante 30 min a 4 °C y a 15.000 xg a 4 °C durante otros 60 min. Esta solución de EX se filtró a través de un filtro de red de nailon hidrófilo con un tamaño de poro de 30 µm (Merck). En el paso final, los EX se aislaron de la solución mediante ultracentrifugación a 100.000 xg durante 2 h a 4 °C (Optima XPN-90, rotor de cubeta oscilante SW32Ti, Beckman Coulter). El sedimento se resuspendió en un tampón PBS nuevo y se repitió este paso. El aislado final se resuspendió en 1 ml de PBS con un cóctel inhibidor completo (Roche) y Marimastat 5 μM (Sigma-Aldrich) y se almacenó a -20 °C para su uso posterior.

El tamaño de las vesículas aisladas se caracterizó mediante el análisis DLS utilizando el instrumento Zetasizer Nano-ZS equipado con un láser He-Ne de 633 nm y un detector posicionado en un ángulo de detección de 173 ° (ZEN3600, Malvern Instruments). Se midieron muestras de un volumen constante de 120 μl con una temperatura controlada a 25 °C y un factor de refracción supuesto de 1,331 en microcubetas de plástico desechables (ZEN0040, Malvern Panalytical). Los datos se analizaron utilizando el software Malvern Panalytical.

NTA analizó el tamaño y la concentración de las vesículas utilizando NanoSight NS3000 (Malvern Instruments). La recolección y análisis de datos se realizó mediante el software NTA. Se cargaron muestras de aproximadamente 300 µl en la cámara de la placa superior de la celda de flujo. La cámara se iluminó desde abajo con un rayo láser de 405 nm, lo que provocó la dispersión de la luz por las partículas de la solución de muestra. Cada muestra fue analizada durante 60 s, tres veces.

TEM se realizó con filamento de tungsteno (HT7820 Hitachi). Para obtener imágenes, se descongelaron EX aislados congelados (almacenamiento a - 20 °C), se mezclaron (1:1) con paraformaldehído (PFA) al 4 % (p/v) en tampón de fosfato de sodio (PB) 0,1 M, pH 7,4 y se incubaron en el refrigerar (4 °C) durante la noche. Se depositaron 5 µl de gotas de muestra en parafilm y se colocaron rejillas de formvar/carbono de malla 200 (Merck) encima de las gotas y se incubaron durante 30 minutos. Luego se transfirieron las rejillas a gotas (100 µl) de PB durante 1 min y luego a gotas (20 µl) de glutaraldehído (GA) al 1% en PB durante 5 min. Las rejillas se lavaron con gotas (100 µl) de agua desionizada 8 veces durante 2 min. Finalmente, las muestras se tiñeron con gotas (100 µl) de tinción UranyLess durante 3 a 5 minutos. El resto de UranyLess en las rejillas TEM se secó con papel de filtro y las rejillas se dejaron secar al aire durante 1 h. Las muestras se observaron en modo de contraste con el voltaje acelerado establecido en 100 kV y la corriente del haz en 10 µA. Las imágenes capturadas fueron procesadas por el software de gráficos de mapas de bits Gimp.

La cuantificación de proteínas exosomales se realizó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Merck) y el kit de ensayo de cuantificación de proteínas CBQCA (Thermo Fisher Scientific). Para el ensayo BCA, se mezclaron 25 µl de cada muestra con 200 µl de reactivo de trabajo, seguido de calentamiento a 37 °C durante 30 minutos. Los lisados ​​​​EX se analizaron utilizando 20 μl de cada muestra, 5 μl de RIPA 5 × y 200 μl de reactivo de trabajo y se calentaron a 37 ° C durante 30 min. Todas las muestras se prepararon por triplicado. Se preparó una curva estándar (0–2000 μg/ml) a partir de seis puntos de dilución en serie de albúmina sérica bovina (BSA) y reactivo de trabajo, calentado a 37 °C durante 30 min. El ensayo de cuantificación de proteínas CBQCA se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando PBS 1x en lugar del tampón de borato de sodio 0,1 M. La absorbancia (a 562 nm para el ensayo BCA) y la fluorescencia (excitación 465 nm, emisión 550 nm para el ensayo CBQCA) se midieron en microplacas de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) utilizando el lector de microplacas GloMax Discover (Promega). Los datos fueron analizados por GraphPad Prism (software GraphPad).

Para el aislamiento del ARN exosomal se utilizó el kit exoRNeasy Midi (Qiagen). Se mezclaron 500 µl de EX aislados en PBS con 1 ml de tampón de lisado y se procesaron según el protocolo del fabricante. El ARN aislado se mezcló con tinte de carga de gel de ARN 2X (Life Technologies) y se analizó mediante electroforesis en gel usando gel de agarosa al 1% en tampón TBE 1X (tris 0,13 M, ácido bórico 45 mM, EDTA 2,5 mM) teñido con diluido 10.000X. Tinción de ácido nucleico GelGreen (Labmark) y registrado por el sistema G:BOX gel doc (Syngene). Se utilizó un dúplex de ARNip de 21 unidades con proyección de dTdT (Sigma-Aldrich) como control de carga. La concentración se midió mediante un espectrofotómetro DS-11 FX (DeNovix). Los datos fueron analizados por GraphPad Prism (software GraphPad).

Se utilizó transferencia Western para verificar la presencia de marcadores de exosomas (proteínas de adhesión) en las babosas EX. Se utilizó un tampón de lisis compuesto por RIPA 1X, mercaptoetanol al 5% y PMSF 5 mM para lisar muestras de exosomas. Las muestras se incubaron con tampón de lisis durante 30 minutos a 4 °C, seguido de SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 12%. Las proteínas se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa. Se utilizó leche al 5% en TBST como agente bloqueante y para la dilución de anticuerpos. La membrana se incubó con el anticuerpo primario (diluido 500x en leche al 5% en TBST) durante la noche a 4 °C. Posteriormente, la membrana se lavó seis veces en TBST y se incubó con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h. La membrana lavada se incubó en sustrato de máxima sensibilidad SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific) y se visualizó. Anticuerpos primarios utilizados: anticuerpo Galectina-1/LGALS1, mAb de conejo XP Galectina-3/LGALS3 (D4I2R), anticuerpo recombinante anti-Galectina 8/Gal-8 (Abcam) y mAb de conejo XP Galectina-9 (D9R4A). Anticuerpo secundario: IgG anti-conejo, anticuerpo ligado a HRP. Todos los anticuerpos, excepto Galectina-8, se adquirieron de Cell Signaling Technology.

El procedimiento de carga de EX mediante DOX se adaptó de 71 y se modificó de la siguiente manera (Fig. 3). Se agregaron 5 µl de solución DOX (1000 µg/ml) a 50 µl de exosomas (300 µg/ml de proteínas totales medidas por BCA) en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Para determinar la absorción de DOX por los exosomas, la mezcla se ultracentrifugó durante 30 minutos a 100.000 xg, se descartó el sobrenadante con el DOX libre y los EX se lavaron y resuspendieron en 1 ml de PBS. Este paso se repitió dos veces para eliminar eficazmente el DOX libre residual (Fig. 3). La concentración de DOX en los EX se determinó mediante LC-MS/MS.

Para el análisis LC-MS/MS, la separación se llevó a cabo utilizando un sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity II (Agilent Technologies) con una columna analítica Kinetex Polar C18 de 2,1 × 150 mm, 2,6 µm (Phenomenex) a un caudal de 0,4 ml/ mín. Las fases móviles consistieron en (A) H2O con 0,1% HCOOH y (B) acetonitrilo con 0,1% HCOOH. El sistema HPLC se acopló a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent G6495A equipado con una fuente de ionización por electropulverización Agilent Jet Stream. Las curvas estándar de respuesta de la señal versus concentración para la cuantificación de DOX se crearon trazando la respuesta de la señal en el rango de 0 a 10 µg/l de DOX en PBS. La influencia de la matriz en la determinación de DOX se verificó añadiendo a cada muestra 1 µg/l de DOX.

La línea celular de glioblastoma humano (ATCC) U87 se mantuvo en medio mínimo de águila completo suplementado con aminoácidos no esenciales (NEAA) 100 mM, suero bovino fetal al 10 %, glutamina 2 mM, penicilina 100 µl y estreptomicina 0,1 mg (Thermo Fisher Scientific) . Las células se cultivaron a 37 °C en 5% de CO2.

El cultivo en suspensión Tobacco Bright Yellow-2 (BY-2) de Nicotiana tabacum fue proporcionado por el Instituto de Botánica Experimental de la Academia Checa de Ciencias. Las células se cultivaron en matraces Erlenmeyer en la oscuridad a 26 °C en un agitador (105 RPM). Los medios se prepararon utilizando 4,3 g/l de sal basal de Murashige-Skoog; 30 g/l de sacarosa; 0,2 g/l KH2PO4; 0,1 g/l de inositol; 1 mg/l de tiamina y 0,2 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético. El pH del medio se ajustó a 5,6–5,8 y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 20 min. Las células BY-2 para experimentos se recogieron una semana después de su transferencia a medios nuevos.

Realizamos un ensayo de internalización de EX para evaluar la absorción celular de babosas EX. Se incubaron células U87 (glioblastoma humano) y BY-2 (planta) con EX teñidas con BODIPY TR Ceramide (Thermo Fisher Scientific) durante 4 h. Se incubaron 1 × 108 EX en 100 µl de PBS con 2 µl de BODIPY TR Ceramide según la hoja de datos del proveedor. Posteriormente, los EX marcados se purificaron mediante columnas de centrifugación de exosomas y se incubaron con células. Se utilizaron células no tratadas como control negativo. La absorción de EX se evaluó mediante un objetivo HC PL APO CS2 20 × 0,75 DRY del microscopio CLSM SP8 (Leica) con excitación de 488 nm y emisión de 650 a 750 nm (canal rojo).

La Universidad Jan Evangelista Purkyně es un centro certificado para el uso de animales en investigación (número de aprobación veterinaria CZ 42760032, número de aprobación del Ministerio de Agricultura de la República Checa MZE-19331/2022-13143). ML, OJ están certificados para planificar y realizar experimentos con animales (números de certificado: ML-CZ 03236, OJ-CZ 02834). Ningún animal resultó dañado durante los procedimientos experimentales (recolección de moco).

Todos los datos sin procesar y las imágenes originales de Western Blot están disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Esta investigación fue apoyada por la Agencia de Subvenciones Internas de la Universidad Jan Evangelista Purkyně de Ústí nad Labem (Nº 5322116201301) y por la SGS de la Facultad de Ciencias (Nº 5322715200101); por el proyecto de la Fundación Científica Checa (Nº 20-21421S), por los Fondos Estructurales y de Inversión Europeos en el marco del Programa Operativo Investigación, Desarrollo y Educación: el proyecto FEDER/FSE "UniQSurf: Centro de biointerfaces y materiales funcionales híbridos" ( No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/17_048/0007411), la Infraestructura de Investigación NanoEnviCz (Proyecto No. LM2018124) y Pro-NanoEnviCz (No. de Registro CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001821 y CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015586).

Centro de Nanomateriales y Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad Jan Evangelista Purkyně en Ústí nad Labem, Ústí nad Labem, República Checa

Michaela Liegertová, Alena Semerádtová, Michaela Kocholatá, Michaela Průšová, Marcel Štofik, Jan Malý y Olga Janoušková

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Jan Evangelista Purkyně en Ústí nad Labem, Ústí nad Labem, República Checa

Michaela Liegertová y Lenka Němcová

Departamento de Química y Tecnología Ambientales, Facultad de Medio Ambiente, Universidad Jan Evangelista Purkyně en Ústí nad Labem, Ústí nad Labem, República Checa

Sylvie Kříženecká

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Colección de babosas: ML, AS, LN; colección de moco: ML, AS; aislamiento de exosomas y DLS: AS, ML; Aislamiento y análisis de ARN: MP, ML; NTA y BCA: MK, MP; transferencia Western: MK, OJ, AS; TEM: EM; Carga de DOX e imágenes confocales: DO; CL-EM/EM: SK; ensayos de internalización celular: OJ, MK; análisis de datos y correcciones de manuscritos: JM, OJ; preparación del manuscrito, fotografías (Fig. 5) y esquema (Fig. 3) autoría: ML

Correspondencia a Michaela Liegertová.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Liegertová, M., Semerádtová, A., Kocholatá, M. et al. Vesículas parecidas a exosomas derivadas de moco de la babosa española (Arion vulgaris): aprovechamiento de especies de plagas invasoras en biotecnología. Representante científico 12, 21768 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26335-3

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Recibido: 30 de agosto de 2022

Aceptado: 13 de diciembre de 2022

Publicado: 16 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26335-3

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